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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物塑料飲水瓶消毒條件的優(yōu)化研究
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物塑料飲水瓶消毒條件的優(yōu)化研究龍芝美 吳錦銀 楊光宇 李文學(xué) 朱偉
【摘要】 目的應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的及實(shí)驗(yàn)室常用的高壓滅菌方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物塑料飲水瓶進(jìn)行消毒，觀察三種不同消毒方式（溫度、時(shí)間）消毒后塑料飲水瓶浸出液對(duì)L-929 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法形態(tài)觀察法和WST-1法。結(jié)果三種消毒方式消毒后，細(xì)胞培養(yǎng)基中均未見細(xì)菌生長(zhǎng)。三種消毒方式下，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞存活率和細(xì)胞增殖度均在50%以上。結(jié)論根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，三種高壓滅菌方式對(duì)L929 細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)和增殖有一定程度的影響，其中100℃ 60min的消毒方式較好，無(wú)細(xì)胞毒性作用，消毒后的產(chǎn)品具有良好的生物相容性，符合生物材料應(yīng)用要求。
【關(guān)鍵詞】 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施；細(xì)胞毒性；WST-1法
[Abstract]ObjectiveTo optimize the way of sterilize drinking water utensil used in animal experiment appliance.MethodsCell morphology observation assay and WST-1 assay were used.ResultsAs compared with the control,cell morphology and amount have been affected by the different sterilized ways.ConclusionAccording to the national criterion and the research results,the ways of 100℃ 60min is the better one.
[Key words]SPF grade animal test appliance; Cytotoxicity; WST-1 assay
為保證屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施環(huán)境符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，所有擬進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)部的物品必須經(jīng)過(guò)一定的滅菌方法處理后才能帶入實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)。飲水瓶是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)動(dòng)物飲水裝備，其消毒滅菌措施一般為高壓蒸汽滅菌，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的消毒滅菌溫度為121℃維持20min.在實(shí)際工作中，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物飲水瓶尤其是新塑料飲水瓶在按照上述方式滅菌處理后會(huì)有塑料的臭味，慮及其盛裝的水被直接飲用進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，因此要有良好的理化性能和良好的生物相容性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)評(píng)價(jià)生物材料、醫(yī)療器材或浸提液成分是否具有潛在的細(xì)胞毒性，以其簡(jiǎn)便、快捷、靈敏性高、節(jié)省動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)，被列為評(píng)價(jià)醫(yī)用器材毒性的重要指標(biāo)[ 1,2 ].本試驗(yàn)依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)療生物學(xué)評(píng)價(jià)》（GB/T 16886-2003 ,idt ISO10993-5: 1992），分別采用三種常用的消毒滅菌溫度對(duì)盛裝動(dòng)物飲用水的飲水瓶進(jìn)行高溫蒸汽滅菌，觀察滅菌后瓶中的飲用水對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929生長(zhǎng)抑制的影響，以評(píng)價(jià)這三種滅菌條件何者為優(yōu)，為日常工作提供數(shù)據(jù)支持。
1材料與方法
1.1主要材料及試劑動(dòng)物飲水瓶購(gòu)于中國(guó)江蘇楓葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物籠具廠。L-929小鼠成纖維細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞傳代次數(shù)為3——20.高糖DMEM培養(yǎng)基（粉劑）、新生牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。WST-1細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法取塑料動(dòng)物飲水瓶3個(gè)，按照每平方厘米內(nèi)表面積加入10ml動(dòng)物飲用水的比例分別加入動(dòng)物飲用水，并蓋緊瓶塞。分別采用100℃ 60min、111℃ 40min和121℃ 20min三種滅菌方式處理后，自然冷卻至室溫備用。
1.2.1細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照DMEM培養(yǎng)基（干粉）說(shuō)明書的配制比例，用不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用水溶解培養(yǎng)基來(lái)配制細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值為7.4,用直徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾后，加入10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br />
1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L-929小鼠成纖維細(xì)胞按3×104/ml的密度接種于6孔板，隨機(jī)分為4組，分別是對(duì)照組、1組（100℃ 60min組）、2組（111℃ 40min組）和3組（121℃ 20min組），每組3個(gè)平行樣。細(xì)胞在37℃、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，其余各組則加入用相應(yīng)動(dòng)物飲用水配制的培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱里繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)的第2、4、7天，用光學(xué)顯微鏡對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。
1.2.3測(cè)定細(xì)胞失貼壁率及細(xì)胞活性細(xì)胞分組及處理同上，在細(xì)胞培養(yǎng)的第2、4、7天，收集各組的培養(yǎng)基，同時(shí)用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，PBS清洗2次，加入適量新鮮培養(yǎng)基，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)算失貼壁細(xì)胞數(shù)目及貼壁細(xì)胞數(shù)目，按下式計(jì)算細(xì)胞失貼壁率。細(xì)胞失貼壁率（%）=失貼壁細(xì)胞數(shù)目/（失貼壁細(xì)胞數(shù)目+貼壁細(xì)胞數(shù)目）×100%細(xì)胞按3×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl,細(xì)胞分組及處理同上。在細(xì)胞培養(yǎng)的第2、4、7天，用WST-1法分析細(xì)胞活性，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD）值，按下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖度（RGR）。RGR（%）=實(shí)驗(yàn)組組細(xì)胞OD（490）值/對(duì)照組細(xì)胞OD（490）值×100%按照RGR值將樣品的毒性反應(yīng)分級(jí)如下：0級(jí)為RGR≥100;1級(jí)為75——99;2級(jí)為50——74;3級(jí)為25——49;4級(jí)為1——24;5級(jí)為0.
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析法，組內(nèi)差異比較采用Bonferroni法，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
2結(jié)果
2.1各組L-929細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果可見對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)良好，呈梭形或不規(guī)則的三角形。在用不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用水配制的培養(yǎng)液后第2天及以后，各組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)仍較為良好，但可見少量的細(xì)胞圓縮，偶見懸浮死細(xì)胞。（圖1）。
2.2各組細(xì)胞失貼壁率的變化如表1所示，添加用不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用水配制的培養(yǎng)液后第2天，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞失貼壁率與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性（χ2=1.903,P>0.05）。在第4天，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞失貼壁率均升高，與對(duì)照組相比差異有非常顯著性（χ2=4.262,P<0.000）。在第7天，各實(shí)驗(yàn)組失貼壁率明顯升高（χ2=42.502,P<0.000），其中組3細(xì)胞失貼壁率最高，為8.24%,是對(duì)照組細(xì)胞失貼壁率的10倍以上，差異具有非常顯著性（P<0.01）。表1各組細(xì)胞失貼壁率
2.3各組L-929細(xì)胞活性的變化如表2所示，在添加用不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用水配制的培養(yǎng)液第2天、第4天和第7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組，差異均具有非常顯著性（第2天，χ2=13.205,P<0.000; 第4天，χ2=17.731,P<0.000; 第7天，χ2=21.142,P<0.000）。表2各組細(xì)胞活性
2.4各組L-929細(xì)胞增殖度的變化如表3所示，在添加用不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用水配制的培養(yǎng)液第2天、第4天和第7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖度明顯低于對(duì)照組，差異均具有非常顯著性（第2天，χ2=27.172,P<0.000; 第4天，χ2=15.645,P<0.000; 第7天，χ2=11.087,P<0.000）。各組的細(xì)胞毒性分級(jí)為1級(jí)或2級(jí)。表3各組細(xì)胞增殖度
3討論
體外的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是用來(lái)評(píng)價(jià)材料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況影響的方法，具有通用性，廣泛用于各種器械材料的生物相容性評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)的指標(biāo)一般包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞貼壁狀況、細(xì)胞活性等[2].L-929細(xì)胞是Earle等[3]在1948年從小鼠皮下組織中分離出的成纖維細(xì)胞，常用于材料浸提液的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[4],并被多部國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和衛(wèi)生部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)推薦為評(píng)價(jià)外源性物質(zhì)細(xì)胞毒性首選的細(xì)胞[5——7].為了評(píng)價(jià)不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用瓶的生物安全性，選擇小鼠L-929細(xì)胞作為受試對(duì)象，用添加用不同方式滅菌處理后的動(dòng)物飲用水配制的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，觀察L-929細(xì)胞的毒性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，不同高壓消毒方式消毒后，動(dòng)物飲用水均可使L-929細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生一定程度的改變，細(xì)胞變圓，皺縮，細(xì)胞失貼壁率明顯上升，這些結(jié)果均提示這些高壓消毒方式均會(huì)影響動(dòng)物飲水瓶的生物相容性，綜合比較幾種指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn)100℃ 60min的高壓消毒方式消毒動(dòng)物飲水瓶后，動(dòng)物飲用水的生物相容性與對(duì)照組接近，應(yīng)為較好的高壓消毒方式。
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